申論 4根據由內部標準法（internal standard method）所衍生的分析方法，以高效能液相層析術（HPLC）測量環孢素（cyclosporin A，為預防皮膚與器官移植排斥的免疫抑制劑），所採用的步驟詳述如後。樣品的製備：抽取1毫升（mL）的血漿，其內再添加2毫升的水與乙腈（acetonitrile, CHCN）的混合物（80/20比例），並內含有250奈克（ng,nanogram; 1 ng = 110g）cyclosporin D為內部標準品。（cyclosporin D與cyclosporin A有相似的結構）這3毫升的新混合物，使其通過一個用完即可丟棄的固相萃取分離管柱（solid phase extraction column），以分離留存在吸附劑上的cyclosporins。在分離管柱經過洗滌與乾燥程序後，cyclosporins再以1.5毫升的乙腈洗離，將溶劑蒸發，使其濃縮為200微升（L）。一部分的這個最後溶液，再注射至層析儀中。㈠原始血漿內的cyclosporin A，經此處理後，其濃度為原來的幾倍？（5分）㈡在固相的萃取步驟完成後，可否推斷出cyclosporins的回收率？試述其理由。（5分）樣品：標準品係以不含cyclosporin的原始血漿製備之。擬製備的6個不同的溶液，其內各自添加所需用量的cyclosporin A，以分別產生50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL及1000 ng/mL的濃度。從每一個溶液中抽取1毫升，再添加250奈克（ng）cyclosporinD為內標準品至每一個溶液，然後比照與上述相同的萃取系列流程。所測得之6個標準品校正數據（C vs. R），詳如下表。hng/mL（cyclosporin A濃度）(C)501002004008001000ratio of peaks heights，cyclo. A/cyclo. D(R)h0.250.51.022.044.055.1（cyclo. A與cyclo. D訊號峰的高度比）分離管柱（Column）規格：Supelco 75 4.6 mm、Silica gel（矽膠）3 m、phase（固定相）RP-8。㈢根據下列的層析圖（chromatogram）實驗結果，試推算出血漿中cyclosporin A的濃度（以奈克(ng)/毫升(mL)為單位）。（提示：原始的層析圖中，cyclo. A與cyclo. D訊號峰的高度比為9：14。）本題應以兩種方式求解。（15分）任選一個標準品的校正數據為計算基準。由上表的校正數據，利用線性迴歸法（最小平方法），求出R與C的線h性方程式後，再求算之。（註：以上這兩種求解方式，都是以訊號峰的高度為計算基準。）（註：對於n組數據對(x, y), (x, y),…, (x, y)，以線性迴歸法（最小1122nn平方法）所得到的線性方程式為y = mx + b，其中直線的斜率m，及y截距b，可以下列算式求出：nnnnn2m = [nxy-(x)(y)] / [n(x2)-(x)]iiiiiii1i1i1i1i1nnnnnn2b = [(x2)(y)-(xy)(x)] / [n(x2)-(x)] ）iiiiiiii1i1i1i1i1i1